实验一：果蝇性状观察与雌雄鉴别（点击此下载）

一、实验目的：
学习区别雌雄蝇和观察果蝇主要性状，掌握制备果蝇饲料和进行果一般方法。
二、实验原理：
果蝇为双翅目昆虫，用作实验材料的优点是:生长迅速,生活周期短,没12天左右即可完成一个世代;繁殖力较强,每只受精的雌蝇均可产卵400-500个;因此在短期内即可获得多数子代，有利于遗传学分析；培养条件简易可行；其突变形状多属形态变异，便宜观察，因此，果蝇在遗传学研究中得到广泛应用。
三、实验材料、用具和试剂：
饲养的野生型和几种常见的突变型果蝇。
双筒解剖镜，放大镜，饲养瓶或饲养管，麻醉瓶，白瓷板，棉塞，玻璃棒，镊子，大烧杯，酒精灯。三脚架，石棉网，标签，新毛笔，酒精棉球，吸水纸，玉米粉，琼脂，葡萄糖，酵母（原液或干粉），乙醚，丙酸或乳酸，死蝇盛留器，胶水
四、实验内容和步骤：
一）、制备饲料：
1、准备作为饲养瓶的广口瓶或玻璃管（消毒、干燥）并按饲养器口部大小制备棉塞（消毒）
2、果蝇的幼虫和成虫的主要食物，都是饲料内繁殖的酵母菌。
按照下表成分和下述方法制备饲料。

常用的果蝇饲料及成分

按配方之比例称量所需物品。先用定量中2/3的水将琼脂煮化，再加糖，溶化；再将玉米粉混合于1/3水内，搅匀后倾入琼脂糖夜中，一同煮沸，并随时用玻璃棒搅动，待煮沸数分钟，饲料成为可流动的浆糊状时，即倾入饲养器内。每一饲养器内的饲料厚度约为2CM即可。倾入饲料时，应注意勿使饲料倾在饲养瓶内的侧壁上，以免粘着果蝇。每一饲养器内装好饲料后，立即塞好棉塞，直立在一旁。
（两天后）待凝后，用镊子夹酒精棉球（拧干）将器内侧壁上的水珠和饲料擦干净，滴入1—2滴杀霉剂，并转动饲养瓶，使杀霉剂均匀分布于饲料表面，然后滴入或撒入酵母液或干粉，使其均匀分布于饲料表面。然后再在饲料内插上消毒的吸水纸（作用是吸取水分和供给幼虫化蛹的场所），塞好棉塞，放置于258℃左右的恒温箱内待用。
为了保证酵母菌和果蝇的良好生长和繁殖，必须注意防止霉菌和其他细菌在饲养瓶内繁殖，使用的杀霉剂只有一些抑制霉菌生长的作用，而无绝对防止的作用，因此关键在于各项操作中，严格消毒和灭菌。
二）、观察果蝇性状和雌雄鉴别
1、将准备观察的果蝇倾入用作麻醉瓶的干燥广口瓶内，麻醉瓶的口部大小与饲养瓶口部大小一致，以便倾入果蝇时，果蝇不致飞出。倾倒果蝇时，可将麻醉瓶的底部朝向光亮处，果蝇喜向光亮处飞集，能自然逐渐飞入麻醉瓶内。（或将麻醉瓶自立桌上，装有果蝇的饲养瓶口对口倒置于麻醉瓶上，用手亲拍饲养瓶，果蝇即进入麻醉瓶内。）
2、在原先制好的麻醉棉塞上滴上几滴乙醚，立即将麻醉棉塞塞好已装有果蝇的麻醉瓶，等待3—5分钟，果蝇都停止不动，即可取去麻醉棉塞，将果蝇倾出观察。如果用作杂交亲本或继续饲养的果蝇不能麻醉过度，以免致死（果蝇被麻醉后，若双翅外展呈45°角，即已致死）。如果麻醉不够，中途苏醒，可再麻醉。
3、将已麻醉的果蝇，倾于白瓷板上（或白纸上），置于双筒解剖镜或扩大镜下观察其主要性状,注意认清每一果蝇的复眼颜色，身体颜色，翅的长短及雌雄鉴别。
成蝇的雌雄性别的主要区别；
雌果蝇：
1） 体型较大
2） 腹部末端稍尖
3） 腹背面外观有5条黑色条纹
4） 无性梳
5） 外生殖器外观较简单
雄果蝇：
1） 体型较小
2） 腹部末端顿圆
3）腹背面外观有3条黑色条纹（两窄一宽）
4） 有性梳
5） 外生殖器外观较复杂
五、实验报告内容：
1、制备的饲料种类和饲养瓶（管）数个
2、观察到的果蝇体色，翅形，复眼颜色及雌雄成蝇的外形特征（记看要点并简单图示）
（附：果蝇的生活史）
果蝇的生活史包括卵，爬幼虫，蛹和成虫四个阶段。
卵：羽化后的雌蝇一般在12小时后开始交配，两天后才能产卵，卵长约0.5毫米，椭圆形，腹面稍扁平，在背面的前端伸出一对触丝，它能使卵附着在食物或瓶壁上，不致深陷到食物中。
幼虫：幼虫从卵中孵化出来后，经过两次蜕皮到第三龄，此时体长科达到4~~~5毫米，肉眼观察下可见一端稍尖为头部，并且有一黑点即口器，稍后有一对半透明的唾腺，每条唾腺前有一个唾腺管向前延伸，然后汇合成一条导管通向消化道，神经节位于消化道前端的上方。通过体壁，还可以看到一对生殖腺位于身体后半部的上方两侧，精巢较大，外观为一明显的黑色斑点，卵巢则较小，熟悉观察后可借以鉴别雌雄。幼虫的生活力强而贪食，在培养基上前进时便留下一道沟沟，沟多而宽时，表明幼虫生长良好。
蛹：幼虫生活7~8天后即化蛹，化蛹前从培养基上初附在瓶壁上，渐次形成蛹，起初颜色淡黄，柔软，以后逐渐硬化，变为深褐色，这就将要明显羽化了。
成虫：刚从蛹壳里羽化出的果蝇，虫体较长大，翅膀还没展开，体表也没有完全角质化，所以呈半透明的乳白色，透过腹部体壁还可看到消化腺和性腺，不久，蝇体变为粗短椭圆形，双翅展开，体色加深，如野生型果蝇起初为浅灰色，而后成为灰褐色。
果蝇全部生活史所需的时间，常因饲养温度和饲养条件等而有所不同。当营养条件适宜时，在20℃下饲养，卵——幼虫期平均约为8天，蛹———成虫期约为6..3天，若在25℃下饲养，卵———幼虫期平均约为5天，蛹———成虫期仅需4.2天。因此当营养条件适合而在25℃下饲养，只需10天就可完成一代生活史。普通果蝇的最适宜温度为20——25℃，当温度低于10℃时，生活周期将延长至57天以上，而且生活力明显降低，如果高于30℃时则将引起不育和死亡。

实验二：果蝇一对相对性状的遗传分析
——分离规律的验证

一、实验目的:
学习和掌握果蝇杂交技术，验证分离定律
二、实验原理：
一对相对性状的遗传方式是F代表现亲本之一的显性性状；F代在形成配子时由于成对因子的分离而造成F1代性状的分离。F代配子与分离比是1：1，F1代性状分离比为3：1.
三、实验材料，用具及试剂：
纯系的野生型及不同的突变型处女蝇：灰身、黑身，檀黑身，黄身，长翅，残翅等。
双筒解剖镜（放大镜）、培养瓶，麻醉瓶，乙醚，白瓷板，毛笔，标签，胶水，死蝇盛留器。
四、实验内容和步骤：
实验杂交的雌蝇应为处女蝇：雌蝇孵出后一般在12小时内不进行交配，因此获得处女蝇的方法是：将已孵化出的果蝇从培养瓶中全部移走（注意一个也不能留下），以后12小时内孵出的雌蝇均为处女蝇，即可分别收集杂交亲本用。（如能在八小时内收集更为可靠）一般于前一天晚上八点以后将所有果蝇从培养瓶中移走，第二一天八点收集到的雌蝇均为处女蝇。
1、选取残翅
（Vg/Vg）处女蝇和野生型（+/+）处女蝇作为杂交亲本（或其他具相对性状的类型） ，正反交，各培养一瓶，每一瓶4—5对，记作P，进行杂交组合饲养。
具体方法：按上次实验的麻醉方法，将选取的处女蝇麻醉（注意不能麻醉过度，以免致死），再将已麻醉的处女蝇倒在白瓷板上（或白纸上）置于解剖镜下观察鉴别，（不能稍有错误）。按预定的杂交组合，选取请本果蝇放入一个干净干燥的空管内，用棉塞塞好，并在试管外面贴上标签，写明杂交组合形式（如残翅雌性＊＋／＋雄性），并注明母体及父体个数，等这些杂交亲本已由麻醉状态苏醒，并能活跃飞动时，在再将这些果蝇倾入事先准备好的培养管内，管上贴好标签，注明杂交组合形式，母体及父体个体数目，日期及试验者姓名，进行杂交饲养。
也可在杂交亲本还处于麻醉状态时，放入预先准备好的培养管内，但须避免果蝇接触管内饲料或湿润处，以免果蝇粘在这些地方致死。因此可采取以下作法： 1）、将饲料管放在桌上，然后用纸条将亲本果蝇放在培养管内侧壁上方，塞上棉塞，等果蝇活跃飞行时，再将培养管直立起来。2）、将仍处于麻醉状态的国营（用作杂交亲本）放在干净的白纸上，再将培养瓶倒立，使培养瓶的口部严密罩着亲本果蝇，等这些果蝇活跃飞行时，就自然飞入管内，再将棉塞塞好。（注意千万别写错或贴错标签）
2、将盛有杂交亲本果蝇的培养管，放在适宜温度处（20℃~25℃），棉塞要塞好，切不要无故打开，以免杂菌倾入，若有生霉现象应立即将果蝇换入新培养管内。记录第一个化蛹时间和第一个出蛹时间。
3、7~8天后移出全部亲本果蝇，记录移出时间。
4、待F1代成蝇孵出后，观察其性状并计数，每隔2~3天观察一次并作记录，期间检查3~5次，检出的果蝇移去处理
5、选取F1代果蝇5对移入新培养瓶内互交繁殖（此时不一定用处女蝇，为什么？）每人作两瓶，记录第一个化蛹时间和出蛹时间。
6、7~8天后移出全部F2果蝇，记录移出时间。
7、待F2代成蝇孵出后，观察期性状并记数，其检查3~5次，检出的果蝇移去处理。
8、按下列格式记录所得结果：
（注意计数的准确和观察时的细致）

A 杂交组合 日期 试验者

B、F2互交组合 日期 试验者

统计日期		F2 成蝇表现型及数目		备注
		表现型、数目	表现型、数目
总数	个人
	小组
	全部

9、用X2（卡平方）法测定实验结果是否与理论价值相符。（根据全班观察统计总数进行）

F2 表型	野生型（＋）	残翅（Vg）	合计
实验观察数（0）
理论预期数3：1（e）
差数（d）

因为df=1，须进行连续性校正
所以X 2==
P=
四、实验报告内容：
1、简述实验过程。
2、按实验指导格式列出观察和统计的实验结果和X 2 检验结果。
3、解释说明所得结果，有无规律？有什么规律？
4、在试验技术和统计结果中有无发现什么问题？你对这些问题的看法（原因的分析）。

实验三：果蝇两对相对性状的遗传分析
――――自由组合定律的验证

一、实验目的：
验证自由组合定律。
二、实验原理：
选取具有非同一连锁群的两对相对性状的国营（如灰身长翅与檀黑身残翅）杂交，F1代完全表现显性性状；F1代在形成配子时由于成对因子的分离和非成对因子间自由组合造成F2代性状分离。F1代配子分离比为1：1：1：1.F2代性状分离比为：9：3：3：1。
三、实验材料用具及试剂：
灰身长翅纯种处女蝇及檀黑身残翅纯种处女蝇。（其他同实验二）
四、实验内容及步骤：
1、选取灰身长翅纯种处女蝇及檀黑身残翅雄蝇作为杂交亲本，正反交，个培养一瓶，每瓶4~5对，记作P，进行杂交组合和是饲养。
2、将盛有杂亲本果蝇的培养管放在适宜温度处（20℃~25℃），进行饲养，记录第一个化蛹时间和第一个出蛹时间
3、7~8天移出全部亲本，记录移出时间。
4、待F1代成蝇孵出后，观察其性状并计数，每隔2~3天观察一次并作记录，期间检查3~5次，检出的果蝇移去处理
5、选取F1代果蝇5对移入新培养瓶内互交繁殖（此时不一定用处女蝇，为什么？）每人作两瓶，记录第一个化蛹时间和出蛹时间。
6、7~8天后移出全部F2果蝇，记录移出时间。
7、待F2代成蝇孵出后，观察期性状并记数，其检查3~5次，检出的果蝇移去处8、按下列格式记录所得结果：（注意计数的准确和观察时的细致）

A 杂交组合 日期 试验者

统计日期		F1，成蝇表现型及数目	备注
总数	个人
	小组
	全班

B、F2互交组合 日期 试验者

统计日期		F2 成蝇表现型及数目
总数	个人
	小组
	全部

9、用X2（卡平方）法测定实验结果是否与理论价值相符。（根据全班观察统计总数进行）

F 表型			合计
实验观察数（0）
理论预期数9：3:3：1（e）
差数（d）

X 2== == P==
五、实验报告内容：
1、简述实验过程。
2、按实验指导格式列出观察和统计的实验结果和X 2检验结果。
3、解释说明所得结果，有无规律？有什么规律？
4、在试验技术和统计结果中有无发现什么问题？你对这些问题的看法（原因的分析）。

实验四：伴性遗传试验

一、 实验目的：
了解伴性遗传与非伴性遗传的差别，以及伴性基因遗传在正反交中的差异实
二、 实验原理：
生物的性染色体根性别决定相关，性染色体上基因的遗传方式与性别有关。伴性遗传的主要特点是性状的分离在两性间部一致；正反交结果不一致。在一定的杂交组合下，F1代会出现隐性性状
三、 实验材料用具及试剂：
红眼（+）纯种处女蝇和白眼（VV）白眼纯种处女蝇（其他同实验二）
四、 实验内容和步骤：
1、选取红眼处女蝇与白眼处女蝇作为杂交亲本，分别做正反交各一瓶，每瓶放4~5对。
设：X+X+ XWY……………正交
XWXW X+Y……………反交）

（方法同实验二）
.2、将盛有杂交亲本果蝇的培养管放在适宜温度处（20℃~25℃），进行饲养，记录第一个化蛹时间和第一个出蛹时间
3、7~8天移出全部亲本，记录移出时间。
4、待F1代成蝇孵出后，观察其性状并计数，共检查4~5次，检出的果蝇移去处理
5、将观察统计结果填入下表：

A:（正交）杂交组合 日期 试验者

统计日期	F1代表现型及数目		备注
	红眼	白眼
总计

B:（反交）杂交组合 日期 试验者

统计日期	F1代表现型及数目		备注
	红眼	白眼
总计

五、实验报告内容：
1、简述实验过程
2、按格式列出观察及统计的实验结果。
3、图解实验的果蝇正反交遗传规律并加以解释说明。
4、在实验技术和统计结果中有无发现问题？你对这些问题有何看法（原因分析）

实验五：西藏特色鱼类染色体观察与分析

一、实验目的：
掌握鱼类染色体组型分析方法和步骤，掌握核型公式的分析方法，了解西藏特有鱼类。
二、实验原理：
染色体是遗传信息的携带者，每一种特定的生物都含有特定的染色体，核型公式是分析生物染色体的有效工具。
三、实验材料用具及试剂：
西藏特有鱼类
四、材料：
镊子、手术剪刀、注射器、培养皿、吸管、解剖盘、酒精灯、载玻片、盖玻片、烧杯。
五、仪器：
显微镜、离心器（1000转/分）、离心管、冰箱、玻璃匀浆器。
六、药品：
PHA、秋水仙素、鱼类生理盐水（淡水鱼类是7.5 g/L，海水鱼类是13.5 g/L）、0.075 mol/L KCl、固定液（甲醇、冰醋酸=3：1—1：1）、Giemsa染液、磷酸盐缓冲液（PBS ，pH为6.8或7.4）、中性塑胶。
七、步骤：
1、取谢通门、拉萨河、尼羊河三个地区各30尾雌30尾雄健康黑斑原鮡暂养；
2、然后将黑斑原鮡胸鳍基部注射PHA溶液，注射剂量为2—5цg/g（鱼体重），一次注射；
3、 经6小时后，再注射秋水仙素溶液，也是胸鳍基部一次注射，注射剂量和处理时间见实验设计以及附表；
4、断尾放血，经30分钟后，解剖鱼体，取出头肾，用生理盐水清洗头肾，然后将头肾置于装有适量生理盐水的玻璃匀浆器中匀浆制成细胞悬液；
5、低渗处理：然后将细胞液移入离心管中，离心5分钟，弃去上清夜，加入少量低渗液，用吸管吹打成细胞悬液，然后加入适量的低渗液，处理40分钟左右①；
6、预固定：低渗处理后，向低渗液中加入新配置的1—2ml固定液进行预固定，以防止低渗处理后的细胞在离心时结团。固定液要沿管壁缓缓加入，然后用吸管吹打混匀；
7、第一次固定：预固定1—2分钟后，离心去上清夜，然后向离心管中加入0.5ml的固定液，将细胞轻轻吹打细胞悬液后，加固定液2—5ml，混匀后固定20—30分钟；
8、第二次固定：离心后去上清夜，加固定液2—5ml，混匀后固定20—30分钟；
9、第三次固定：操作同前②。第三次固定后，经离心后去掉大部分清夜，只留0.1—0.2ml固定液，混匀后即可滴片制作染色体。也可冷冻过夜，第二天离心，加少许固定液（甲醇：冰醋酸=1：2—1：1）混匀，然后加适量该固定液固定20—30分钟，离心5分钟，去大部分清夜，混匀滴片制作染色体。视效果而定，建议用后一种方法；
10、滴片：使用高纯水制备的冰水片进行滴片（可增加滴片清晰度）。用吸管吸取细胞悬液，距滴片5cm左右距离滴片，每张载玻片滴1—3滴（根据悬液的浓度）。滴片后斜放，室温干燥，亦可滴片后即刻用嘴轻轻吹片，可帮助细胞和染色体分散。亦可滴片后用酒精灯外焰干燥，视观察效果而定③；
11、Giemsa染色：染液为1/10的Giemsa染液（PBS：Giemsa原液=9：1），染色30—60分钟后，自来水冲洗，自然凉干；
12、组型分析：取100个图象清淅、染色体分散较好的中期有丝分裂细胞，高倍镜检，确定染色体众数，择优取30个细胞测量其染色体臂长，计算相对长度，臂比等，以Levan分类标准进行分类、配对，计算染色体臂数，得出核型公式。

＊ ① 低渗处理是获得分散良好的分裂相的关键步骤。过度与不足都会造成不好的影响。在低渗处理时细胞十分娇嫩，并且表面发粘，如需混匀细胞悬液时，最好用吸管向低渗液中吹气，以避免细胞破碎。
在整个操作过程中，要注意不要将细胞吸到吸管上部，也不要接触离心管的上部，否则将会丢失许多细胞。
摸索低渗时间，建议延长低渗处理时间至6—8个小时 ；
② 充分的固定是制备良好分散的染色体色重要步骤。如果染色体分散的不好，可在余下的细胞悬液中改为固定液（1：2—1：3），有时可改善由于低渗处理不够或不充分所造成的缺陷。
固定液要新配置，否则将会形成脂类，影响固定的效果。
③ 滴片是制备染色体的最后一步，也是非常关键的一步，首先载玻片要非常干净，否则将会影响染色体的分散和分带的效果，建议对载玻片进行预处理，提前酒精消毒，冰水处理（玻片上应有一层薄的冰霜）。分裂相过多或过少，染色体过于分散都会影响到分带、染色效果和观察；
比较自然干燥法和酒精灯干燥的效果。
④ 摸索染液处理时间，取效果好的时间段；
⑤ 鱼体标记：标记方法依具体情况而定，或剪须标记（须的位置、数量），或剪鳍标记，或挂牌标记，建议挂牌标记；
⑥ 制备好染色体片后，用二甲苯处理１—２小时，目的是使染色体片清晰，然后用中性塑胶封片，用记号笔作标记，以便回校观察；
⑦ 每次离心后应尽可能的去掉上清夜，但又要注意不使细胞丢失；每次加液后用吸管吹打时，用力要均匀，也不要过猛，以能使细胞团散开为准；
⑧ 低渗时间过长，细胞膜过早破裂，造成染色体有丢失；如低渗处理不够，细胞尚未胀开，则染色体往往分散不好，仍成团，不利于观察计数分析。此外要注意低渗处理的温度与时间，一般在室温条件下处理，时间要长些，在37摄氏度，时间要短些。
八、作业：
1、为什么要进行低渗处理
2、为什么要进行固定
3、怎样才能保持滴片干净
4、对所研究藏鱼进行染色体核型分析

实验六：西藏特色畜禽染色体观察与分析

一、实验原理
在骨髓细胞中，有丝分裂的指数是相当高的，因此可以直接得到中期细胞而不必像血淋巴细胞那样要经过体外培养。通过活体注射秋水仙素，可以使部分细胞的分裂停止在中期，再经过低渗、固定就可获得大量的有丝分裂细胞。
通过骨髓得到染色体是比较简便的，一般也无需无菌操作。在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映。
直接制片法是直接从骨髓中取出细胞，经压片法或空气干燥法制片。所谓空气干燥法，实际上是将细胞经过秋水仙素处理——低渗处理——充分的固定——滴片等步骤之后在载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载片在室温下自然干燥的方法。
二、实验材料、器具和试剂
出雏3日龄之内的雏鸡（按羽色自别配套）、显微镜、2毫升注射器、10毫升离心管、吸管、试管架、载玻片、恒温水浴锅、离心机、剪刀、解剖刀、蜡盘、。2ml注射器、5号针头、10ml刻度离心管、吸管、试管、试管架、载玻片、盖片、离心机、显微镜、解剖器具（剪刀、镊子等）。
试剂：秋水仙素溶液（0.02%）、0.075MKCl、冰醋酸、甲醇、Giemsa母液。
三、方法步骤
1．秋水仙素处理 取材前2～3h，给雏鸡腹腔注射秋水仙素溶液，剂量为2～4微克／克活重。
2．杀鸡取髓 用断颈椎方法处死雏鸡，取出胫骨和股骨，剔净皮肉，用自来水将肌肉碎渣冲洗干净。用剪刀剪掉胫骨和股骨两端，用2毫升注射器吸取等渗液2%柠檬酸钠溶液通过5号针头注入骨髓腔反复4-5次将骨髓细胞冲入离心管。共收集细胞悬液5～6毫升。平衡，1000转/分离心8分钟，弃上清。
3．低渗 向试管内加预热的0.075MKCl溶液，置37℃恒温水浴锅内低渗20～21分钟。
4．预固定 低渗结束时，加入3-5滴新配甲醇-冰醋酸固定液，立即混匀，平衡，1000转/分离心8分钟，弃上清。
5．第一次固定 加入新配甲醇-冰醋酸固定液5-6毫升，用吸管轻轻吸打均匀，静置20分钟。1000转/分离心8分钟，弃上清。
6．第二次固定 加入新配甲醇-冰醋酸固定液5-6毫升，用吸管轻轻吸打均匀，静置20分钟。1000转/分离心8-10分钟，弃上清。
7．滴片 加入适量（4～6滴）固定液制成细胞悬液，滴两滴于冰冻的载玻片上，空气干燥。
8．将染色体制片反扣于染色板上，用1：9Giemsa稀释液染色30分钟，自来水冲洗，干后，显微镜下观察。
四、作业
1、为什么要选取骨髓作为畜禽染色体分析材料
2、分析所研究畜禽的染色体核型公式

实验七 果蝇唾腺染色体标本制备和观察

一、实验目的和要求
1．了解3龄幼虫的饲养特点
2．熟练取出黒腹果蝇的唾腺
3．掌握压片法制备果蝇唾腺染色体
4．要求参加实验的学生认真预习实验指导，认真阅读参考资料。事先了解实验原理、材料和方法以及实验步骤。
二、实验分组
一个班约30人不分组人人都做该实验。
三、实验材料、器具和试剂
材料：黑腹果蝇三龄幼虫，选择迟缓、肥大，爬上管壁的3龄幼虫最佳。
器材：显微镜、解剖镜、解剖针、载玻片、盖玻片、
试剂：生理盐水（0.7%NaCl）、5%的醋酸洋红（或石炭酸）、滤纸片。
松香石蜡：用等量的松香和52℃石蜡放在蒸发皿内用小火煮（大火会烧起来），待两者充分混合成浓的米黄色，取下来冷却凝固。使用时，用烧热铁丝的前端沾有少量的溶解物，封在载玻片周围。
四、方法步骤
1．三龄幼虫的饲养 专供果蝇唾腺染色体压片的幼虫必须十分肥大，发育良好的唾液腺在解剖镜下面可以清楚地看到为数不多的较大的腺体细胞，取其染色后压片，可望获得理想的唾腺染色体。
2．从培养基中挑选一只肥大的三龄幼虫。
3．将幼虫放在载玻片上，加上一小滴生理盐水，置于解剖镜下。
4．两手各执一支解剖针，一支固定在幼虫躯干部（身体末端1/3处），另一支固定在头部（口器的后部），用力向前拉，把头部自身体拉开，唾腺即随之而出。唾腺为一对透明状的长圆物体（图3-4）。

图3-4 果蝇唾腺

a肛门，h后肠，g盲囊，mi中肠，i唾腺原基，mh大腺沟，o食道，ph咽头，pr前胃，
sd唾腺分泌管，sq唾腺，mt马氏管
5．仔细将唾腺与其他组织分离（如脂肪组织和拉断的消化道部分）待分离后用滤纸擦去其他组织。（注意勿使唾腺干燥）。
6．滴两滴醋酸洋红染液，染色20～30分钟。
7．用滤纸吸去多余的染液，重新加入一小滴染液。加上盖片。
8．用大拇指在盖玻片上用力压，以使唾腺细胞中的染色体破核而出。
9．置显微镜下观察。
10．好的片子用松香石蜡封片。另一种封片是用加拿大胶，即将上述压片放在95%的酒精蒸汽中固定24h后，再放在95%的酒精中轻轻取下盖片，稍擦净后滴一滴封片用的加拿大胶，盖上一片干净的盖片即制成永久片。
11．果蝇唾腺染色体标本观察 先在低倍镜观察片子，找到好的染色体图象后，放到视野中心，再用高倍镜观察。
黑腹果蝇的唾腺染色体是2n=2×4=8。但因短小的第4染色体和X染色体的着丝粒在端部，所以染色体的一端在染色中心上，看上去，各自只形成一条线状和点状的染色体。只有第二和第三染色体的着丝粒在中央，它们从染色中心以V字形向外伸出（图3-5）。

图3-5 果蝇唾腺染色体模式图

五、作业
1．何谓果蝇的三龄幼虫？
2．你是否顺利取到果蝇唾腺？有什么体会？画出果蝇唾腺示意图。
3．为什么说果蝇唾腺染色体是多线染色体？
4．为什么说果蝇唾腺染色体是研究染色体畸变最好的实验材料？
附：参考资料：果蝇唾腺染色体的特殊性
上世纪初，D.Kostoff用压片法首先在D.melanogaster果蝇幼虫的唾腺细胞核中发现了特别巨大的染色体——唾腺染色体（s a l i v a r y g l a n d c h r o m o s o m e s），这种染色体宽约5微米，长约400微米，相当于普通染色体的100～150倍，由于它具有许多重要特点而成为细胞遗传学、发生遗传学、进化遗传学和分子遗传学研究不可多得的好材料。
唾腺染色体经过多次复制而并不分开，大约有1000～4000根染色体丝的拷贝，所以又称为多线染色体。多线染色体经过染色后，出现深浅不同，密疏各别的横纹，这些横纹的数目和位置往往是恒定的，代表着果蝇等昆虫的种的特征。如染色体有缺失、重复、倒位、易位等，很容易在唾腺染色体上识别出来。
双翅目昆虫的整个消化道细胞（从唾腺直到直肠）发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂，停止在间期。但随着幼虫整体器官以及这些细胞本身体积的增大，细胞核的染色体，尤其是唾腺染色体仍不断地进行自我复制而并不分开。据估计，大约有1000－4000条染色丝的拷贝形成一束巨大染色体，因此，唾腺染色体又称为多线染色体。
由于唾腺细胞在果蝇的幼虫时期永远处于分裂的间期状态，所以每一条核蛋白丝都处于伸展状态，因而它不同于其他细胞分裂中期时的高度螺旋化的染色体。

实验八：核酸的琼脂糖凝胶电泳

一、试剂及配方:
0.5M EDTA：EDTA 93.06 g，加蒸馏水溶解，至500ml，用NaOH调pH值至8.0。
5×TBE缓冲液：Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5M EDTA（PH=8.0）20ml，加水至1000mL。
30% PAGE：丙烯酰胺290g，甲叉丙烯酰胺10g，加去离子水溶解，定容至1000ml，4℃保存
10%过硫酸铵：过硫酸铵10g，加去离子水溶解定容100ml，4℃保存，在30天内使用。
TEMED：4℃保存。
0.1％ AgNO3：取0.5 g AgNO3（由于配的是500ml的故0.1×500/100＝0.5g），加去离子水至500ml溶解。
显色液（3% NaOH）：取15g NaOH，加去离子水至500ml溶解，加0.076g四硼酸钠和800ul甲醛。
二、操作过程:
12%非变性聚丙烯胺凝胶（25ml体积，0.1厘米胶条）制作及电泳：
（1） 清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，晾干后上垫条,用夹子夹好.
（2） 在100ml烧杯内加入30%丙烯酰胺10.0ml，2.5ml 50%的甘油，5 ml5×TBE 5ml， 10%过硫酸铵0.175ml，TEMED 8μl，加入纯水7.325ml，混合后迅速灌胶；此为一块胶的量，多块胶时按比列加倍.
（3） 当灌胶至玻璃板上沿0.1cm是停止灌胶，插入梳子，室温聚合半小时，多余的丙烯烯胺保存。随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯烯胺；
（4） 凝胶聚合好后，向电泳槽加入1×TBE（可用5×TBE100 ml定容到500即可），用注射器冲洗加样空；
（5） 预电泳10分钟，同 时准备点样；
（6） 取1μlPCR产物置于PCR管中，加5μl变性Buffer， 离心混匀.98度变性10分钟；（一般的PAEG胶不需要此步骤）
（7） 迅速冰浴10分钟， 用微量注射器点样；（一般的PAEG胶不需要此步骤）
（8） 打开电源，150伏电泳14-16小时。
硝酸银染色方法：
1． 用去离子水冲洗胶；
2． 用0.1％ AgNO3 染色液染色30～40min；
3． 去离子水冲洗2遍；
4． 用3％ NaOH显色液（每500ml显色液中加0.076g四硼酸钠、800ul甲醛）显色10～20分钟；
5． 用去离子水冲洗多余的显色液
6． 保鲜膜封好，观察和照相
三、经验和注意事项:
（1）冲洗玻璃板用自来水即可，不必用去离子水或蒸馏水；
（2）玻璃板及其它器物要及时清理，不然当胶凝固后很不好清洗；
（3）梳子和垫条要搭配好，不要用较薄的梳子配较厚的垫条，这会导致许多碎胶，不易冲洗干净点样孔，影响点样；
（4）刚烘干的玻璃板如温度较高应在冷却后再注胶，不然，显色后会有水印；
（4）如显色后条带较浅，可能是由于染色时温度较低，可通过加热水和染、显色溶液而得到改善，但不易太热（如高于35度），这会加深胶的背景。

实验九：PCR技术与分析

基因扩增技术（PCR）聚合酶链反应（polymerase chain reaction简称PCR）又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品，因而此方法立即在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、简便等优点，已在病原微生物学领域中显示出巨大的应用价值和广阔的发展前景。　　PCR技术是由Cetus公司和加利福利亚大学1985年联合创造的，主要贡献者为Kary B mulis和HeneryA、Erlich。该方法首先被应用于人β-珠蛋白DNA的扩增及镰刀状红细胞贫血病的产前诊断。自85年首次报道PCR方法以来，PCR被广泛应用于分子克隆、序列分析、基因突变、遗传病、传染病、性传播性疾病及法医判定和考古研究等多领域、并发挥了越来越大的作用。因而发明人Kary B、mulis获1993年诺贝尔化学奖。　　为了使PCR技术在临床上迅速得以普及，我们对该技术的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技术变得简单、微量化、不易发生污染，从而使PCR技术常规化成为可能。我们的方法迅速在全国各大医院得到推广。我们通过老师的演示试验，要求学生们掌握以下的基本理论与基本技能的学习：
一、PCR的基本原理和基本程序
　　PCR扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段，一般需20-30个碱基对，过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后，以靶DNA单链为模板，经反链杂交复性（退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）为原料按5’到3’方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。引物在反应中不仅起引导作用，而且起着特异性的限制扩增DNA片段范围大小的作用。新合成的DNA链含有引物的互补序列，并又可作为下一轮聚合反应的模板。如此重复上述DNA模板加热变性双链解开—引物退火复性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循环过程，使每次循环延伸的模板又增加1倍，亦即扩增DNA产物增加1倍，经反复循环，使靶DNA片段指数性扩增。
二、PCR的特点
（一）特异性高：首次报导的PCR所用的DNA聚合酶是大肠杆菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段，其酶活性在90℃会变性失活，需每次PCR循环都要重新加入Klenow大片段，同时引物是在37℃延伸（聚合）易产生模板—引物之间的碱基错配、致特异性较差，1988年Saiki等从温泉水中分离到的水生嗜热杆菌中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶，在热变性处理时不被灭活，不必在每次循环扩增中再加入新酶，可以在较高温度下连续反应，显著地提高PCR产物的特异性，序列分析证明其扩增的DNA序列与原模板DNA一致。扩增过程中，单核苷酸的错误参入程度很低、其错配率一般只有约万分之一，足可以提供特异性分析，选用各型病毒相对的特异寡核苷酸引物。PCR能一次确定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物检测病妇宫颈刮片细胞可以发现部分病人存在HPV11和HPV16两型的双重感染。 　　
（二）高度敏感：理论上PCR可以按2n倍数扩增DNA十亿倍以上，实际应用已证实可以将极微量的靶DNA成百万倍以上地扩增到足够检测分析量的DNA。能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人口液等只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品中均可检测。
（三）快速及无放射性：一般在2小时内约可完成30次以上的循环扩增，加上用电泳分析。只需3-4小时便可完成，不用分离提纯病毒，DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物，可直接用临床标本如血液、体液、尿液、洗液、脱落毛发、细胞、活体组织等粗制的DNA的提取液来扩增检测，省去费时繁杂的提纯程序，扩增产物用一般电泳分析即可，不一定用同位素，无放射性易于推广。
（四）简便：扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱繁琐的基因方法，可直接从RNA或染色体DNA中或部分DNA已降解的样品中分离目的基因，省去常规方法中须先进行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的组织或切片亦可检测。如在PCR引物端事先构建一个内切酶位点，扩增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相应酶切位点的载体中。
（五）可扩增RNA或cDNA：先按通常方法用寡脱氧胸苷引物和逆转录酶将mRNA转变成单链cDNA，再将得到的单链cDNA进行PCR扩增，即使mRNA转录片段只有100ngcDNA中的0.01%，也能经PCR扩增1ng有242碱基对长度的特异片段，有些外显子分散在一段很长的DNA中，难以将整段DNA大分子扩增和做序列分析。若以mRNA作模板，则可将外显子集中，用PCR一次便完成对外显子的扩增并进行序列分析。
三、PCR方法
（一）试剂
（1）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生物都有自己特异的引物。
（2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。
（3）10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl（pH8.4,20℃）150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。
（4）5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。
（5）DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、操作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。
（二）操作程序　　
过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。具体如下：
（1）向一微量离心管中依次加入
　　DNA模板　　　　　　 102-105拷贝
　　引物　　　　　　　　　 各1μmol/L
　　dNTP　 　　　　　 各200μmol/L
10×PCR缓冲液　　1/10体积
ddH2O　　　　　补到终体积（终体积50μl-100μl）
混匀后，离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用，现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液，引物，ddH2O混合在一起，反应体积为20-25μl，只要试验人员加入处理好的样品就可以了。
（2）加石蜡油50-100μl于反应液表面以防蒸发。置反应管于97℃变性10min。
（3）冷至延伸温度时，加入1-5u Taq DNA聚合酶，离心30s使酶和反应液充分混合。现在临床使用试剂酶通常已加入反应液中。
（4）PCR的循环程序为：94℃变性30s，55℃退火20s，然后在72℃延伸30s，共循环30-35次。最后一次循环结束后，再将反应管置72℃温育5min，以确保充分延伸。
PCR尚可用于组织标本DNA的扩增。由于固定组织标本的DNA常发生降解，就给常用的分析方法如Southern转印杂交等带来一定困难。87年Impraim等人首先将PCR技术引入固定包埋组织内DNA分析。他们先从组织标本中提取DNA，再用PCR进行特异性的DNA扩增，应用这种方法，他们成功地从保存30至40年之久的组织标本DNA中扩增了HPV病毒基因片段。但这种方法需要提取DNA，操作比较繁琐。1988年Shibata等人对Impraim的方法进行了改进。他们将固定包埋的组织块制成5-10um厚，0.4cm大小的切片。将切片放入容积为500μl的Eppendorf管内。加入400μl二甲苯脱脂，离心除去二甲苯，用400μl 95%乙醇洗去残余二甲苯。离心除尽乙醇、加入100μlPCR反应基质，将Eppendorf管放入沸水浴中煮10min，然后按前述PCR方法进行DNA扩增。
在应用PCR方法检测RNA病毒时，首先应将RNA转化成cDNA才能进行扩增，因为PCR只能对DNA模板进行扩增，我们把这种RNA的PCR反应称为反转录PCR，简称RT-PCR。把由RNA转化成DNA的过程叫做反转录，反转录需要在反转录酶的作用下完成。
四、PCR反应的基本条件及其对PCR的影响
（一）模板核酸　　
PCR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。不过RNA的扩增首先逆转录成cDNA后才能进行PCR循环。不同来源的核酸标本必须经处理后才能用于PCR的扩增，处理不当或处理过程中DNA掉失都会导致PCR扩增失败。采集标本方法不当，未能获得所要检测的靶DNA都会导致出现假阴性。但是如果待扩增标本中模板DNA浓度太高也会导致扩增失败。
（二）引物　　
PCR结果的特异性取决于引物的特异性，扩增产物的大小也是由特异引物限定的。因此，引物的设计与合成对PCR的成功与否起着决定性的作用。合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱嘌呤产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。因此，PCR所用引物质量要高，且需纯化。冻干引物于-20℃至少保存12-24个月，液体状态于-20℃可保存6个月。引物不用时应存于-20℃保存。
　　PCR反应中引物的量也影响PCR扩增效果，当PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。一般认为PCR反应中引物的终浓度为0.2～1μmol/L为宜，但我们实验发现，最适浓度远远低于此浓度。
（三）缓冲液
PCR反应的缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一个最适酶催反应条件。目前最为常用的缓冲体系为10-50mmol/L　Tris-HCl （pH8.3-8.8,20℃） Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，△pKa值为-0.021/℃。因此，20mmol/l Tris-HCl（pH8.3,20℃）在实际PCR中，pH变化于6.8-7.8之间。改变反应液的缓冲能力，如将Tris浓度加大到50mmol/L，pH8.9,有时会增加产量。
　　反应混合液中50mmol/L以内的KCl，pH8.9有利于引物的退火，50mmol/l NaCl或50 mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH+4代K+，其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明胶（0.01%）或Tween 20（0.05% ～0.1%）有助于酶的稳定，反应中加入5mmol/l 的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用，尤其在扩增长片段（此时延伸时间长）时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。
（四）Mg2+
Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性，这是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它还影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，通常会导致非特异性扩增产物的累积。PCR混合物中的DNA模板，引物和dNTp 的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。因为Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。　　
（五）三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）　　
四种脱氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反应中dNTP含量太低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过高的dNTP浓度会导致聚合将其错误掺入（即所谓的“热力背信”），因此应当避免。一般认为最适的dNTP浓度为50～200μmol/L。dNTP的质量也直接影响PCR反应的成败。　　
（六）耐热DNA聚合酶
PCR之所以能得到广泛应用，主要是因为Taq DNA聚合酶取代了大肠杆菌DNA聚合酶I大片段。Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus（Taq）中分离出的热稳定性DNA聚合酶，使用Taq DNA聚合酶不仅简化了PCR程序，也极大地增加了PCR特异性及PCR扩增效率。该酶的最适温度很高（79℃），使引物在高温下进行退火和延伸，这样便增加了反应的总强度并减少了与错配引物的延伸。在PCR反应中，每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增。Taq DNA聚合酶保存不当而失活是PCR实验失败的常见原因。　　
（七）温度循环参数　　
1．变性温度与时间
PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR产物双链完全解开，才能有效的和引物结合。这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高，时间越长变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响Taq DNA聚合酶的活性，所以通常选用变性温度为95℃30s为宜。在PCR反应中第一个循环变性最重要，需时间较长，因模板DNA的链比较长。
2．复性温度与时间
变性温度是PCR反应成败的关键，复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但是容易出现引物与靶DNA的错配，增加非特异性结合，温度太高不利于复性，大多数PCR反应的复性温度在55℃左右。确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。
3．延伸温度与时间
引物延伸温度一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的活性，又考虑到引物和靶基因的结合。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量，72℃时，核苷酸的合成速度为35-100个核苷酸/S，这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。对很低浓度底物的扩增，延伸时间要长些。
4．循环数：　　
循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。靶序列的初始浓度较低时、要增加循环次数。另外，酶活性不好，或量不足时也要增加循环次数、以便达到有效的扩增量。　　
五、PCR标本的制备
在将Taq DNA聚合酶引入PCR反应，并使之达到自动化之后，PCR反应已变得十分的简单了。但是PCR样品的采集及制备却并非同样简单，而且，许多PCR的失败都归因于标本的制备不当。用于PCR的标本必须经适当处理后才能使用，因为标本中的许多杂质能抑制Taq DNA聚合酶的活性。另外，处理标本可使待扩增DNA暴露，能与引物复性。关于PCR标本制备各种专业书中介绍了许多，我们实验发现操作复杂、不慎便容易造成污染，且不实用。现介绍一种简单快速的处理方法即3%异硫氰酸胍和待检标本混合100℃，10min，离心取上清作为PCR模板即可。
六、PCR扩增产物的分析法
PCR扩增DNA片段只是一个重要手段。扩增片段的检测和分析才是目的，根据研究对象和目的的不同而采用不同的分析法。琼脂糖凝胶电泳可帮助判断扩增产物的大小，有助于扩增产物的鉴定，点杂交除可鉴定扩增产物外，还有助于产物的分型；Southern杂交分析可从非特异扩增产物中鉴定出特异产物的大小，增加检测的特异性与敏感性，最近发展的一系列产物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于产物的精确分析。
凝胶电泳分析法：PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以前者最常用，通过电泳可以判断扩增产物的大小。在临床检测中，仅通过凝胶电泳判断扩增片段大小即可满足检测的需要。通常制胶方法为100mlTBE加1.5g琼脂糖在微波锅内溶解，稍冷后倒入电泳槽。
电泳后，用溴化乙淀染色20min，然后用去离子水漂洗2次，每次15min，于UV灯下观察结果并拍照。凝胶电泳不仅可以鉴定产物的大小，检测扩增的情况，还可以用来纯化扩增产物。