实验一 普通光学显微镜的构造和使用与微生物形态的观察

［普通光学显微镜的构造和使用］

1．构造

普通光学显微镜的构造、使用与保护方法已在《家畜组织学与胚胎学》教材中讲过，这里介绍油镜的原理和使用要点：

检查细菌标本，多用油镜进行。油镜是一种放大倍数较高（90～100倍）的物镜，一般都刻有放大倍数（如95×、100×等）和特别的标记，以便于认识。国产镜多用油字表示，国外产品则常用“Oil＇’（Oil Immersion）或“HI”（Homogeneous Immersion）作记号。油镜上也常漆有黑环或红环，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一个标志。

2．油镜的原理

油镜头的晶片细小，进入镜中的光量亦较少，其视野较用高倍镜为暗。当油镜头与载玻片之间为空气所隔时，因为空气的折光指数与玻璃不同，故有一部分光线被折射而不能进入镜头之内，使视野更暗；若在镜头与载玻片之间放上与玻璃的折光指数相近的油类，如柏木油等，则光线不会因折射而损失太大，可使视野充分照明，能清楚地进行观察和检查。

3．油镜的使用方法

进行油镜检查时，应先对好光线，但不可直对阳光，采取最强亮度（升高集光器，开大光圈，调好反光镜等）。然后在标本上加柏木油一滴（切勿过多），将标本放置或移置载物台的正中。转换油镜头浸人油滴中，使其几乎与标本面接触为度（但不应接触）。用左眼由目镜注视镜内，同时慢慢转动粗螺旋，提起镜筒（此时严禁用粗螺旋降下油镜筒），至能模糊看到物像时，再转动微螺旋，直至物像清晰为止。另一种是固定镜筒调节载物台的显微镜，调焦时，镜片先与油镜头接触，再慢慢转动粗螺旋，将载物台往下调，能模糊看到物像时，再转动微螺旋，直至物像清晰为止。随即进行检查观察。油镜用过后，应立即用擦镜纸将镜头擦拭干净。如油渍已干，则须用擦镜纸蘸少许二甲苯溶解并拭去油渍，然后再用干擦镜纸拭净镜头。

［荧光显微镜］

荧光显微镜（fluorescent microscope）是用来观察荧光性物质，特别是供免疫荧光技术应用的专门显微镜。荧光性物质含有荧光色素，当受到一定波长的短波光（通常是紫外线部分）照射，能够激发出较长波长的可见荧光。利用这一现象，把荧光色素与抗体结合起来，进行免疫荧光反应，可以在荧光显微镜中观察荧光影像，以作各种判定。

荧光显微镜的构造，也是以普通光学显微镜为基础，其显微部分也是一般的复式显微镜系统，但其光源与滤光部分等则有所不同。

光源：荧光显微镜必须有发出高能量紫外线的光源，一般使用超高压水银灯。这种光源大，除紫外线外，还具有可见光。

滤光片：为了只许紫外线等特定激发光线通过，而阻止其他光线通过，以免影响标本中的荧光影像，在光源灯与反光镜之间安装一种激发滤光片（或称一次滤片），为了只让荧光通过而阻止紫外线通过，以保护观察者的眼睛，在目镜与物镜之间（或目镜内），安装另一种滤光片，也叫保护滤光片（或称二次滤光片）。滤光片有各种型号，各有一定的滤光范围，两种滤光片必须适当配合，应根据所用荧光色素吸收光波（吸收光谱）和激发的荧光光波（荧光光谱）的特性去选择使用。

反光镜：普通光学显微镜所用的镀银反光镜，对紫外线反光不好。荧光显微镜的反光镜，多用镀银，可以较好地反射紫外线。

进行荧光显微镜镜检时，应先将光源调节好，使得最强光线通过标本，将反光镜和集光镜与光源相互配合，即可达到目的，然后升高集光器，并在其上滴加一滴无荧光的镜油（普通柏木油会发生荧光，不能使用）。在载物台上放上标本片，使其底面与镜油接触，与集光器连在一起，即可进行低倍镜或高倍镜检查。如用油镜观察，则标本片上也要滴加无荧光镜油。操作方法同暗视野显微镜。由于照射在标本上的光线是肉眼看不见的紫外线，无荧光物质，肉眼就看不见而呈黑暗背景，只有荧光物质，才能发生荧光，在黑暗背景中发亮，容易观察。荧光物质受紫外线照射时间过长，荧光会逐渐消失，因此，在镜检时应抓紧时间观察，不宜在同一部位观察时间过长。也可采取转换视野或间歇开（看时）、关（不看时）光源的办法，以作调节。

专门的荧光显微镜配合恰当，透镜系统质量优良，或以石英代替玻璃，使更多紫外光能通过，效果较好，但也可用普通光学显微镜代替。使用明视野显微镜集光器，或者为了减少可见光的干扰，使用暗视野集光器都可以。只要将光源和滤光装置等安排好，也能得到良好的效果。

［细菌的基本形态及构造的观察］

细菌是单细胞生物，尽管个体微小，但有其完整的形态特征和结构。细菌的基本形态可分为球状、杆状和螺旋状三种。除细胞壁、细胞膜、细胞质和核质等基本结构外，尚有鞭毛、菌毛、芽孢、荚膜、质粒等附属结构。

［目的要求］

（1）认识细菌的基本形态和构造。

（2）通过细菌标本片观察，进一步熟悉光学显微镜的使用。

［实验材料］

显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸。

细菌标本片：革兰氏染色的葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、弧菌、大肠杆菌等，巴氏杆菌、炭疽杆菌的姬姆萨染色的组织触片，其他观察芽孢、鞭毛、荚膜等结构的特殊染色标本。

［实验内容］

1．细菌的形态

（1）球菌

链球菌：注意其链状排列，链的长短、个体的形态。

葡萄球菌：注意其无一定次序，无一定数目，不规则地堆在一起的形态。

（2）杆菌

单杆菌：注意其单个散在的状态，菌体外形、大小，菌端的形态。

双杆菌：注意其成双的排列以及菌体外形、大小，菌端的形态。

链杆菌：注意其成链状排列，链的长短，菌体的外形、大小，菌端的形态。

（3）螺旋状

弧菌：注意其弯曲成弧形以及菌体大小，菌端的形态。

螺菌：注意其具有两个弯曲以上的螺旋状及菌体的长度、大小，菌端的形态。

2．细菌的特殊构造

（1）荚膜：注意荚膜的位置、形状、大小、染色及相互间的联结。

（2）鞭毛：注意鞭毛的形态、长度、大小、数目及在菌体上的联排列（单毛、丛毛、周毛）。

（3）芽孢：注意芽孢的形状与菌体相比的大小以及在菌体中的位置（中央、偏端、末端）。

（4）异染颗粒：注意其与菌体不同的染色反应、形状、大小、多少、位置等。

［思考题］

1、你所观察的标本片的细菌有哪些形态？

2、绘出所观察标本的细菌形态图。

实验二 细菌抹片的制备及染色

细菌细胞微小，无色而半透明，直接在普通光学显微镜下观察，只能大致见到其外貌，制成抹片和染色后，则能较清楚地显示其形态和结构，也可以根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种依据。

常应用各种染料对细菌进行染色。由于毛细管、渗透、吸附和吸收等物理作用以及离子交换、酸碱亲和等化学作用，染料能使细菌着色，并且因细菌细胞的结构和化学成分不同而有不同的染色反应。

［目的要求］

（1）掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法

（2）认识革兰氏染色和抗酸染色的反应特性。

［实验材料］

（1）载玻片、接种棒、酒精灯、火柴、吸水纸、生理盐水、各种染色液等。

（2）菌种：大肠杆菌、炭疽杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌的斜面、培养物和肉汤培养物各一管。

［实验内容］

1．细菌抹片的制备

进行细菌染色之前，须先作好细菌抹片，其方法如下：

（1）玻片准备：载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有残余油渍，可按下列方法处理：滴95％酒精2～3滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯外焰上轻轻拖过几次。若仍不能去除油渍，可再滴1～2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯外焰上轻轻拖过。

（2）抹片：所用材料情况不同，抹片方法也有差异。

液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等）可直接用灭菌接种环取一环材料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

非液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。

组织脏器材料可先用镊子夹持中部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压印（触片）或涂抹成一薄层。

如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，亦可在同一张玻片上有秩序地排好，做多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。

（3）干燥：上述涂片应让其自然干燥。

（4）固定：有两类固定方法。

a火焰固定：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯外焰上如钟摆样来回拖过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手为度）进行固定。

b化学固定：血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色，不用火焰固定，而用甲醇固定，可将已干燥的抹片浸入甲醇中2～3min，取出晾干；或者在抹片上滴加数滴甲醇使其作用2～3min，自然挥发干燥，抹片如做瑞氏染色，则不必先做特别固定，染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。

抹片固定的目的有如下几点：

第一点：除去抹片的水分，涂抹材料能很好地贴附在玻片上，以免水洗时易被冲掉。

第二点：使抹片易于着色或更好地着色，因为变性的蛋白质比非变性的蛋白质着色力更强。

第三点：可杀死抹片中的微生物。

必须注意，在抹片固定过程中，实际上并不能保证杀死全部细菌，也不能完全避免在染色水洗时不将部分抹片冲脱。因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的抹片时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。

固定好的抹片就可进行各种方法的染色。

2．几种常用的染色方法

只应用一种染料进行染色的方法称简单染色法，如美蓝染色法。应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法称复杂染色法。染色时，有些是将染料分别先后使用，有些则同时混合使用，染色后不同的细菌或物体，或者细菌构造的不同部分可以呈现不同颜色，有鉴别细菌的作用，又可称为鉴别染色，如革兰氏染色法、抗酸染色法、瑞氏染色法和姬姆萨染色法等。

（1）美蓝染色法

细菌菌体蛋白质的等电点多偏酸性（pH2.0～5.0），而细菌生活环境的pH在7.0左右，此时，细菌菌体带负电荷，极易与碱性美蓝染料结合呈蓝色。

在已干燥固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖涂抹点即可）美蓝染色液，经1～2min，水洗，干燥（可用吸水纸吸干，或自然干燥，但不能烤干），镜检。菌体染成蓝色。

（2）革兰氏染色法

革兰氏染色法的机理仍不太清楚，但一般认为与细菌细胞壁的结构和化学成分有关。革兰氏阴性菌的细胞壁，其脂类含量较多，当以95％酒精脱色时，脂类被溶去，使得细胞壁孔隙变大，尽管95％酒精处理能使肽聚糖孔隙缩小，但因其肽聚糖含量较少，细胞壁缩小有限，故能让结晶紫（或龙胆紫）与碘形成的紫色染料复合物被95％酒精洗脱出细胞壁之外，而被后来红色的复染剂染成红色。而革兰氏阳性细菌细胞壁所含脂类少，肽聚糖多，经95％酒精脱色时其细胞壁孔隙缩小到不易让结晶紫（或龙胆紫）与碘形成的紫色染料复合物洗出细胞壁外，而被染成紫色。染色步骤为：

a在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经1～2min，水洗。

b加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1～3min，水洗。

c加95％酒精于抹片上脱色，约0.5～1min，水洗。

d加稀释的石炭酸复红（或沙黄水溶液）复染10～30s，水洗。

e吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

（3）抗酸染色法

抗酸杆菌类一般不易着色，需用强浓染液加温或延长时间才能着色，但一旦着色后即使用强酸、强碱或酸酒精也不能使其脱色。其原因有二：一是细菌细胞壁含有丰富的蜡质（分支菌酸），它可阻止染液透人菌体内着染，但一旦染料进入菌体后就不易脱去；二是菌体表面结构完整，当染料着染菌体后即能抗御酸类脱色，若胞膜及胞壁破损，则失去抗酸性染色特性。

a 萋-尼（Ziehl-Neelsen）氏染色法：首先在已干燥、固定好的抹片上滴加较多的石炭酸复红染色液，在玻片下以酒精灯火焰微微加热至产生蒸汽为度（不要煮沸），维持微微产生蒸汽，经3～5min，水洗。然后用3％盐酸酒精脱色，至标本无色脱出为止，充分水洗。再用碱性美蓝染色液复染约lmin，水洗。最后吸干，镜检。抗酸性细菌呈红色，非抗酸性细菌呈蓝色。

b Kinyoun氏染色法：固定后的抹片上滴加Kinyoun氏石炭酸复红染液，历时3min。此液配法为：

碱性复红，4g；95％乙醇，20mL；石炭酸，9mL；蒸馏水，100mL。将碱性复红溶于酒精，再缓缓加水并摇振，再加入石炭酸混合。

连续水洗90s后滴加Gabbott氏复染液染色lmin。此液配法为：美蓝，1g；无水乙醇，20mL；浓硫酸，20mL；蒸馏水，50mL。先将美蓝溶于乙醇，再加蒸馏水，再加硫酸。

连续水洗lmin，吸干，镜检。抗酸菌呈红色，其他菌呈蓝色。

c 石炭酸复红染色法：滴加石炭酸复红染液于抹片（已干燥固定过的）上染lmin；水洗；再用1％美蓝酒精液复染20s；水洗、干燥、镜检。抗酸性菌呈红色。镜检前对光检查染色片，标本片务必呈蓝色，如标本片呈现红色或棕色，表示复染不足，应再复染5～10min，再观察，如仍未全呈蓝色时，仍可反复复染，至符合要求为止。

（4）瑞氏染色法

瑞氏染料是碱性美蓝与酸性伊红钠盐混合而成的染料，当溶于甲醇后即发生分离，分解成酸性和碱性两种染料。由于细菌带负电荷，与带正电荷的碱性染料结合而成蓝色。组织细胞的细胞核含有大量的核糖核酸镁盐，也与碱性染料结合成蓝色。而背景和细胞浆一般为中性，易与酸性染料结合染成红色。

a抹片自然干燥后，滴加瑞氏染色液于其上，为了避免很快变干，染色液可稍多加些，或看情况补充滴加；经1～3min，再加约与染液等量的中性蒸馏水或缓冲液，轻轻晃动玻片，使之与染液混合，经5min左右，直接用水冲洗（不可先将染液倾去），吸干或烘干，镜检。细菌染成蓝色，组织细胞的细胞胞浆将呈红色，细胞核呈蓝色；

b或抹片自然干燥后，按抹片点大小盖上一块略大的清洁滤纸片，在其上轻轻滴加染色液，至略浸过滤纸，并视情况补滴，维持不使变干；染色3～5min，直接以水冲洗，吸干或烘干，镜检。此法的染色液经滤纸滤过，可大大避免沉渣附着抹片上而影响镜检观察。

（5）姬姆萨染色法

原理与瑞氏染色法相同。

a于5mL新煮过的中性蒸馏水中滴加5～10滴姬姆萨染色液原液，即稀释为常用的姬姆萨染色液。

b抹片甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量染色液或将抹片浸入盛有染色液的染缸中，染色30min，或者染色数小时至24h，取出水洗，吸干或烘干，镜检。细菌呈蓝青色，组织细胞胞浆呈红色，细胞核呈蓝色。

［思考题］

1．制备细菌染色标本片时，应注意哪些事项?

2．涂片固定的意义何在?固定时应注意什么问题?

3．革兰氏染色的原理及染色成败的关键步骤是什么?

4．比较常用细菌染色方法的异同及主要适用范围。